m6A简介

      N6-甲基腺苷 （m6A） 甲基化是真核生物中最常见的内部RNA修饰形式，m6A 在正常和异常的生物过程中发挥着多功能作用，近年来越来越受到关注并成为研究热点。作为对mRNA 和非编码 RNA 最普遍的表观遗传修饰，m6A 甲基化可影响 RNA 代谢，从而以转录后的方式参与蛋白质表达与调控。 

m6A调控因子

A、Writers

甲基化执行者：METTL3, METTL14, METTL16, WTAP, RBM15/15B, VIRMA, ZC3H13等；

功能：负责行使甲基转移酶功能，催化RNA的甲基化并负责维持m6A甲基化的稳定性。

B、Readers

m6A位点识别者：YTH 家族、IGF2BPs、HNRNP 家族、eIF3等；

功能：识别m6A，引发一系列下游生物学反应，如RNA降解，增强翻译，剪切事件，影响出核等等

C、Erasers

去甲基化执行者：FTO and ALKBH3/5；

功能：参与去除RNA上的甲基，介导去甲基化过程。

 

m6A研究策略

 

m6A研究相关技术

A、MeRIP-seq

甲基化RNA免疫共沉淀 (methylated RNA Immunoprecipitation，meRIP)基于抗体特异性结合甲基化修饰的碱基的原理，以RNA免疫共沉淀富集甲基化修饰片段为基础，然后通过高通量测序，在全转录组范围内研究发生甲基化的RNA区域，高效获得结果。

 

B、Dot bolt

斑点杂交（Dot blot）是将被检标本点到膜上，烘烤固定。然后与m6A抗体(Western blot)杂交后检测，可用于半定量检测。

 

C、双荧光素酶实验

双荧光素酶系统经常用于m6A修饰位点的检测。通过把修饰位点克隆至双荧光报告质粒上，通过qpcr或者报告荧光强弱显示修饰位点对RNA的稳定性影响或者翻译效率的影响。

 

D、actinomycin D assay

放线菌素D（Actinomycin D）可在数分钟内被细胞吸收，并优先嵌入到富含GC的DNA序列中，形成稳定的复合物，抑制所有真核RNA聚合酶的转录进程。利用放线菌素D处理不同时间长度后，检测目标RNA（如mRNA、lncRNA）的分子水平，推算目标RNA的半衰期，评估其稳定性。

 

E、puromycin assay

嘌呤霉素是一种氨基核苷酸抗生素，是蛋白合成抑制剂，可通过核糖体中的过早链终止来阻止翻译。抗嘌呤霉素抗体，可检测掺入到蛋白质中的嘌呤霉素。这使其可与标准免疫化学方法一起使用来检测翻译效率。